肠肝分流驱动的胆血症易致肝癌

我们在C57BL/6小鼠中寻找HCC的早期预后指标，我们发现当饲喂富含发酵纤维的饮食时，C57BL/6小鼠容易发生HCC。这些标记被用于表型和确定HCC发展的阶段。使用从HCC/病例对照队列中前瞻性收集的血清来检测它们的人类相关性。

小鼠的HCC倾向取决于先天存在的门静脉系统分流(PSS)的存在，这导致血清胆汁酸(BAs)显著升高。来自不同来源的约10%的小鼠表现出PSS/胆血症，但在喂食标准饲料时缺乏明显的表型。然而，PSS/胆汁血症小鼠饲喂特定成分的饲料，发生了BA-和环氧合酶依赖性肝损伤，当饲料中富含可发酵纤维菊粉时，肝损伤加剧并发展为HCC。胆汁淤积性HCC的进展与加剧的胆血症和免疫抑制环境有关，这两者都是通过阻碍BA生物合成或中和白细胞介素-10或程序性死亡蛋白1来预防HCC所必需的。人类血清分析显示BA升高与未来HCC的发展有关。

PSS在C57BL/6小鼠中相对常见，并引起无症状的胆血症，易导致肝损伤和肝细胞癌，特别是当喂食可发酵富含纤维的食物。人类无症状PSS/胆血症的发生率有待调查。无论如何，测量血清BA可能有助于HCC风险评估，潜在地提醒特定的个体考虑饮食或BA干预。

许多小鼠表现出有缺陷的血管系统，易患胆血症和肝细胞癌。血清胆汁酸升高可以在临床诊断前多年预测人类肝癌。

病毒、酒精引起肝癌比例成下降趋势，HCC的病因是多因素的，由无数的因素决定，包括遗传、饮食和肠道菌群组成。在小鼠模型中，脱氧胆酸的喂养通过抑制抗肿瘤免疫而加重肝癌，其中肝癌是由致癌物和高脂饮食诱导的。研究表明，胆血症(即血清总胆汁酸[TBA]升高)与HCC相关，且是HCC所必需的，通过一些(约40%)toll样受体5缺陷(Tlr5KO)小鼠中饲喂含菊粉饲料证实。然而，TBA升高的原因以及为什么它只在一个小鼠子集中被观察到仍然是未知的。我们通过大群小鼠研究揭示，这种饮食诱导的HCC并不完全依赖于toll样受体5的缺失。相反，大约10%的C57BL/6小鼠，无论来源如何，在生命早期表现出胆血症。这种胆血症是肝脏血管系统缺陷的结果，即门系统分流PSS。PSS/胆汁血症小鼠缺乏明显的基础表型，但容易发生饮食诱导的胆汁淤积性肝损伤，最终导致肝细胞癌，特别是在饲喂抑制免疫的富含发酵纤维的饮食的小鼠中。在人类相关性研究中发现，血清TBA升高与发生肝癌的风险有关。因此，我们的研究结果促进了对HCC病理生理学的理解，将PSS和胆血症定义为小鼠实验研究的关键变量，并提出了一种有助于预测和预防人类HCC的策略。

首先， 饲养小鼠，饲喂特定饮食，在15、28天采下颌血，按TBA是否<40 uM分为高胆红素组和低胆红素组，小鼠门静脉注射树脂，结果100% (45 / 45)H-TBA小鼠出现PSS，而0% (0 / 50)L-TBA小鼠出现PSS。确定高胆红素为PSS表型。

L-TBA小鼠在ICD（由7.5%菊粉和2.5%纤维素组成）喂养24周后发生了胆汁淤积性HCC，因此，HCC的倾向与先前存在的胆汁血症紧密相关。

为了验证菊粉的可发酵性与肝癌的促进有关，我们用纤维素(一种不可发酵的纤维)取代菊粉。与ICD喂养的H-TBA小鼠相比，喂食CCD的H-TBA小鼠表现出高胆红素血症，但氨化程度较低，血清碱性磷酸酶和AFP含量较低，8只CCD喂养的H-TBA小鼠中有2只HCC，肿瘤的数量和大小都有所减少。另外6只出现肝纤维化和增生。为了测试是否是肠道细菌发酵纤维导致了HCC，我们给ICD喂养的小鼠使用广谱抗生素，抗生素治疗有效。因此，H-TBA小鼠非常容易发生HCC，这需要既存在的胆汁血症，又需要肠道微生物对膳食纤维进行发酵。

门系统分流引起肠肝胆汁酸外溢 为了解胆汁血症的基础，对L-TBA、H-TBA小鼠进行靶向代谢组学分析。H-TBA小鼠血清中所有主要的初级、次级、非共轭和共轭BAs均升高。但BA关键生物合成基因Cyp7a1和Cyp7b1的表达呈下降趋势，H-TBA小鼠肝脏中Cyp8b1和Cyp27a1表达下调。胆血症可能不是由新生BA的产生驱动的;相反，高水平的循环次级BAs暗示肠肝循环异常。

3万人中就有1人由于静脉导管未闭而在出生时患有先天性PSS，这使门静脉血液泄漏到循环中我们推测患有先天性PSS的人会有较高的血清TBA，另一组人是获得性PSSs，其发病率在肝硬化后相对较高，尽管我们观察到肝硬化本身与TBA升高有关，但PSS患者TBA升高的程度更大。只有携带PSS的Tlr5KO小鼠在喂食ICD时发生了胆汁淤积性HCC(补充图6C-H)。这些结果表明，PSS和胆汁血症是WT和Tlr5KO小鼠易患icd诱导的HCC的基础。老年L-TBA小鼠在喂食ICD后不能避免发生HCC，长期食用富含发酵纤维的饲料可能会促进BA和HCC升高，即使没有先天性PSS。

门系统分流与肝功能和代谢功能障碍有关 维持GBC的H-TBA小鼠的典型特征显示体重轻度升高，并伴有暴饮暴食。H-TBA小鼠也有低血脂、低血糖、对胰岛素高度敏感(导致更好的糖耐量)，并有脂肪吸收障碍。H-TBA小鼠仅表现出轻微的胆红素血症，这与ICD喂养的H-TBA小鼠中HCC的一致发展形成了鲜明的对比，这可能反映了肝脏管理PSS提供的初始“打击”的能力，但当出现第二次打击时，如富含发酵纤维的饮食时，就不存在这种能力。

在饮食和胆汁酸依赖的方式下，门系分流易导致肝损伤 H-TBA小鼠的饮食从GBC改为ICD如何导致HCC，给H-TBA而不是L-TBA喂食ICD的小鼠会引发胆汁淤滞性肝损伤的快速发作。这种损伤与肠道渗透性增加有关，因为在H-TBA小鼠中，ICD喂养会增加该参数，而L-TBA小鼠则不会。此外，ICD喂养的H-TBA小鼠显示出对细菌蛋白的血清免疫反应性增强，这表明肠道细菌和/或其产物的传播/易位增加。

在H-TBA小鼠中，胆酸诱导的血清TBA升高要大得多，可能反映了PSS绕过了肝脏对BA水平的控制。此外，胆酸导致严重的肝损伤，对H-TBA小鼠是致命的(图3I-M)。有趣的是，H-TBA小鼠接受熊去氧胆酸(已知可降低BA池的疏水性)，18不会加重肝损伤(图3H-K)或导致发病率。这些结果表明，在PSS小鼠中，BA在超过一定阈值时可产生毒性，其毒性与其疏水性有关。

ICD上调了血清TBA和Cyp7a1的肝脏表达，但没有上调其他参与BA生物合成的基因的表达。这使我们推测ICD可能通过增加BA池到促进肝损伤的水平来发挥其病理作用。事实上,我们观察到的H-TBA小鼠在ICD后4周内肝脏Cox2表达升高，尽管Cox1和Alox5没有升高。给H-TBA小鼠服用COX抑制剂吲哚美辛足以逆转icd诱导的胆汁淤滞损伤。总的来说，这些结果暗示了PSS、icd诱导的损伤、BA和cox依赖性炎症之间的联系。

阻断胆汁酸生物合成防止含菊粉饮食诱导的肝细胞癌 与Cyp7a1在BA生物合成中的关键作用一致，Cyp7a1KO小鼠没有胆血症，它们一致表现出TBA <40 mM。尽管如此，约10%的Cyp7a1KO小鼠TBA、>10 mM明显升高。这种H-TBA Cyp7a1KO小鼠表现为低胆固醇血症，进一步表现为PSS(图4B和C)。尽管表现为PSS，但ICD喂养后它们的胆汁淤积反应减弱，对HCC具有耐药性(图4D-H)。

接下来，我们测试了通过腺病毒介导的成纤维细胞生长因子15 (Cyp7a1的负调控因子)过表达对Cyp7a1的治疗性阻断是否可以保护H-TBA小鼠对抗HCC。与此观点一致的是，腺病毒成纤维细胞生长因子15的应用挽救了H-TBA WT小鼠免于肝损伤和HCC。总的来说，这些结果表明PSS不是胆血症的结果。相反，他们认为胆血症以一种依赖于cyp7a1的方式对PSS作出反应，从而介导PSS的致癌后果。

门系统分流驱动型肝细胞癌的免疫抑制和免疫衰竭 CCD和ICD都能引起HTBA小鼠的肝损伤，但只有ICD才会引起HCC。ICD喂养的H-TBA小鼠也不同于ccd喂养的小鼠，表现出更大的免疫抑制效应物上调，即白细胞介素(IL)-10、分泌性IL-1受体拮抗剂、程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)和肝脏中的IgA。结果支持了ICD诱导的免疫抑制。给关键免疫抑制介质缺乏的HTBA小鼠喂食ICD，小鼠也表现出PSS，但发病率降低，向HCC的进展缓慢。结果表明，肝细胞癌肝损伤的进展是由ICD喂养引起的免疫抑制环境驱动的。为了测试PD-1/PD-L1通路是否有助于肝肿瘤的发生，对icd喂养的H-TBA小鼠进行PD-1的阻断。尽管这种干预没有减轻胆汁淤积损伤，但它改善了HCC。这些结果表明，免疫衰竭有助于H-TBA小鼠HCC的发展。

胆汁酸升高预示人类肝癌 血清TBA升高可能与晚年患肝癌的风险有关。参与者在研究基线(1985-1988)提供血液样本，并在2014年之前前瞻性随访肝癌的发展。我们分析了从224名后来发生原发性肝癌的男性中收集的血清(从基线到肝癌的中位时间为15.6年;范围，8.6-21.2)和未患肝癌的匹配对照。总的来说，在后来发展为肝癌的男性中，平均血清TBA水平比基线高2倍。使用多变量调整模型，我们发现高TBA水平与4.2倍的肝癌风险增加相关。血清总胆固醇与随后的肝癌发展呈负相关。结果表明，胆血症和低胆固醇血症可进一步作为肝癌的独立危险因素进行检查。纤维摄入可降低29%的肝癌风险(优势比，0.71;95% CI, 0.25 – 2.05)。在高TBA的男性中，高纤维摄入量与40%的肝癌风险增加相关(优势比，1.40;95% CI, 0.50-3.96)。综上所述,这些在血清TBA水平较高的个体中，高纤维饮食可能不能预防HCC，相反，正如小鼠研究得出的结果，在某些情况下，特别是胆血症，某些膳食纤维可能促进肝癌的发展。

有些人和老鼠天生就有PSS，它允许门静脉血液绕过肝脏。尽管人们可能会认为这种分流会增加细菌代谢物的循环水平，但事实上，正是宿主衍生代谢物(即BAs)水平的升高，才让我们认识到PSS的后果。具体地说，我们发现PSS在小鼠中异常会导致胆血症，胆血症本身在临床上无症状，但易导致肝损伤和随后的HCC。BA升高不仅是HCC进展的标志，而且更可能引发肝损伤并发展为HCC。口服胆酸可引发肝损伤，通过基因消融或成纤维细胞生长因子15过表达对Cyp7a1的阻断不仅可防止胆血症，还可产生肝保护作用。吲哚美辛干预，逆转了icd诱导的胆汁淤积性肝损伤。因此，我们得出结论，PSS易发生肝损伤和肝细胞癌，依赖于BA和cox(环氧酶)。除了标志肝损伤和HCC进展外，BAs可能是肝脏疾病的关键介质。对于高BAs的人，可能存在未诊断的肝功能障碍，如果食用丰富膳食纤维，可出现scfa介导的免疫应答抑制可能增加发展为HCC。故应个体化饮食，高TBA者应区分纤维类型和来源。

建议卫生保健系统考虑将血清BAs的测量纳入常见的代谢筛查组，从而可能有助于识别无症状肝脏异常(包括PSS)的人，这些异常会增加疾病(包括HCC)的风险。我们建议HCC发展的高危人群或处于早期阶段的人群可以从限制食用富含发酵纤维的食物中受益。